监测细胞内环境变化的化学传感器可以为各种生物过程提供重要的参考。例如，亚细胞温度传感可能有助于提供有关基因表达、细胞分裂和酶反应的信息。因此，开发一种用于亚细胞pH和温度传感的荧光传感器具有重要意义。PAs是一种可见光响应光开关。在本文中，作者利用PAs闭环到开环的温度依赖性热弛豫，将其用于细胞中的荧光温度传感。
方案1 PA-allyl、PA-NO2和PA-OMe的化学结构和合成路线。
如方案1所示，作者合成了具有给电子和吸电子取代基的PAs，分别命名为PA-PA-allyl、PA-OMe和PA-NO2。图1a-c显示了在不同pH值的水性缓冲液中测定的PAs的吸收光谱。在酸性pH条件下，PA-allyl和PA-NO2分别在420 nm和 410 nm处出现吸收峰。PA-OMe在374和458 nm 附近存在两个吸收峰。随着pH的增加，PA-allyl、PA-NO2和PA-OMe的吸收峰分别移动至550 nm、510 nm 和 580 nm处，并观察到移动与pH呈比率变化，而这种比率变化对应于开环形式的酸碱反应。通过Henderson-Hasselbalch方程得出PAs的pKa值分别为5.2（PA-allyl）、4.7（PA-NO2）和5.9（PA-OMe）。pH响应还伴随着明显的颜色变化（图1d-f插图）。
图1（a–c）调整至不同pH值的通用缓冲溶液（硼酸、柠檬酸和磷酸钠）中0.3 mM PA-allyl、PA-NO2和PA-OMe的UV-Vis吸收光谱。（d–f）用最大吸光度对pH值评估PA的pH响应。
作者通过动力学法监测不同光照下的吸光度变化来评估PAs的光开关动力学。为了比较它们对光的反应，pH值保持在4.6，对应于溶酶体pH值。首先在455nm光下照射PA溶液，然后在黑暗中监测热弛豫（图2b）。光开关行为受到不同取代基的影响。对于PA-allyl和PA-NO2，开环形式能够异构化为闭环螺环形式，分别导致420和418 nm处的吸光度降低（图2b）。PA-OMe在光照射下没有表现出明显的光致变色变化。PA-allyl在420nm的吸光度能够在黑暗中迅速恢复（荧光热弛豫寿命约42s），而PA-NO2在418nm的吸光度恢复则相反非常缓慢（约20min）。取代基的影响与文献的报道一致，并证实了给电子基团可以加速开环反应。
图2 (a) PA-allyl的pH相关光开关反应示意图。(b) 在第一次蓝光激活 (455 nm) 时，PA-allyl在 420 nm 处吸光度的动力学演变，然后将样品置于黑暗中以允许热弛豫。(c) 监测 PA-烯丙基在10 ℃至50 ℃时的热弛豫。(d)与作为 1/T 函数的对数寿命lnτ绘制的线性关系。
从闭环到开环的反应称为PAs的热弛豫。对于PA-allyl，其热弛豫强烈依赖于温度。如图2c所示，当温度从10℃逐渐升高到50℃时，黑暗中的自发开环反应变得越来越快。420 nm处吸光度变化的动力学监测与对应于一级反应动力学的单指数衰减函数非常吻合。得到了温度倒数（1/T）和对数寿命（lnτ）之间的线性关系（图2d）。值得一提的是，随着pH值的增加，热驰豫变得明显加快。然而，pH响应在不同温度下几乎保持不变，这意味着温度变化对pH测定的干扰可以忽略不计。
为了确认PAs是否与荧光显微镜兼容，作者使用荧光光谱测试了PA-allyl的pH和温度响应。如图3a所示，PA-allyl的质子化和去质子化形式分别在570nm和674nm处存在发射峰。在含有PA-allyl的相同缓冲溶液中，分别以488 nm和561 nm激发得到500-620 nm和600-750 nm的荧光光谱。根据绿色和红色发射强度比（I560/I665，图3b）观察到S形pH响应。同时，还测试了PA-allyl对温度的荧光响应。如图3c所示，在用450nm光照射20秒后，监测了PA-llyl水溶液（200mM，pH 4.6）的荧光恢复速度。随着温度的升高，荧光恢复变得越来越快，且lnτ和1/T之间存在线性关系（图3d）。
图 3 (a) 质子化（黑色，450 nm激发，含TFA的乙醇溶液测定）和去质子化（红色，550 nm 激发，含氢氧化钠的乙醇溶液测定）形式的PA-allyl荧光发射光谱. (b)基于560 nm与665 nm发射强度比的PA-allyl的 pH 响应。(c) 监测PA-allyl（在 pH = 4.6 的通用缓冲液中为 0.2 mM）从15.0到 45.0℃的荧光热弛豫。(d)c中对数寿命 lnτ与1/T 的线性关系。
PA-allyl的弱碱性及其热弛豫温度依赖性使其可能用于监测亚细胞的pH和温度。如图4所示，HeLa细胞在10mM PA-allyl存在下在Dulbecco改良Eagle培养基中培养，用磷酸盐缓冲溶液洗涤，并在共焦激光扫描显微镜（CLSM）下成像。来自商用染料LysoTracker深红色的发射，使得溶酶体在图4b的橙色通道中显色。绿色通道显示出PA-allyl在488nm激发下从500到640 nm的发射。橙色和绿色通道显示出明显的叠加，皮尔逊共定位系数为0.81。这说明PA-allyl能够染色溶酶体。
图4 PA-烯丙基在 HeLa 细胞中的共定位。(a) 明场。(b) 橙色通道：LysoTracker 深红色。激发：640 nm，发射：640–700 nm。(c) 绿色通道：PA-allyl。激发：488 nm，发射：500–640 nm。(d) 橙色、绿色和亮场通道的叠加。
为了测试PA-allyl是否能够监测溶酶体pH值的变化，作者用一种V-ATP酶抑制剂巴菲霉素A1（BA1）刺激PA-allyl染色的HeLa细胞。收集了去质子化PA-allyl的红色发射（600–700 nm）和质子化PA-allyl的绿色发射（500–600 nm）。溶酶体的pH值通常约为4.6。BA1的使用能提高溶酶体pH值。因此，红色/绿色的发射比率应该增加，实验证明在BA1刺激后观察到这种变化（图5a）。这些结果表明，PA-allyl可用于定性监测亚细胞溶酶体pH变化。
图 5 (a) CLSM 下细胞器亚群的发射强度比（红/绿）统计。红色条：BA1 刺激前。蓝色条：BA1 刺激后 20 分钟。37.5 1C。(b) 分别在 27.0、31.5、35.0、37.0 和 43.0 1C 下，用 PA 烯丙基染色的 HeLa 细胞的荧光恢复寿命的对数作为 1/T 的函数绘制的线性关系。细胞在 488 nm 下预照射 10 秒以强制进行闭环反应。
为了评估PA-allyl是否可以用于监测细胞水平上的温度变化，作者测试了PA-allyl染色的HeLa细胞在不同温度下成像。首先用488nm光预照射细胞使PA-allyl转化为闭环形式。然后将细胞置于黑暗中并记录固定时间点的一系列图像。自发开环反应导致荧光强度逐渐增加，且在27至43℃的温度下的速率不同。结果表明对数荧光热弛豫寿命与倒数温度1/T之间存在线性关系（图5b）。还注意到，PA-allyl在细胞中的热驰豫比在DMSO水混合溶剂中的慢。总的来说，这些结果表明PA-allyl的热弛豫对于监测细胞温度变化具有广阔的前途。
综上所述，作者利用PAs从闭环到开环的温度依赖性热弛豫，设计了一种用于亚细胞的荧光温度传感器。闭环形式PAs的对数热驰豫(lnτ)对温度的倒数表现出极好的线性响应。此外，开环PAs能够染色溶酶体并对溶酶体pH值变化做出反应。这些特性使PAs有望成为亚细胞pH和温度传感的荧光探针。
文献详情
题目：Visible light responsive photoacids for subcellular pH and temperature correlated fluorescence sensing
作者：Yu Cheng,‡ Xueqing Ma,‡ Jingying Zhai and Xiaojiang Xie*
引用：Chem. Commun. 2023
DOI：10.1039/d2cc06816h
湖南大学何清课题组
研究方向｜超分子化学
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